Extracción Total de ADN
¿Cuál es la función principal del detergente SDS al 1% en la Solución II durante la lisis bacteriana?
Desnaturalizar las proteínas de la pared celular y solubilizar los lípidos de las membranas plasmáticas
¿Qué ventaja importante tienen los kits comerciales de extracción de ADN frente a los métodos tradicionales?
Son más rápidos, seguros, reproducibles y fáciles de usar.
¿Hacia qué polo migra el ADN durante la electroforesis y por qué?
Hacia el polo positivo (ánodo), porque el ADN tiene carga negativa debido a sus grupos fosfato.
¿Por qué se deben cambiar las puntas de micropipeta entre cada muestra al cargar el gel?
Para evitar la contaminación cruzada entre muestras, lo que podría generar resultados falsos
¿Por qué la Solución II (SDS/NaOH) debe prepararse al momento y no guardarse por largos periodos?
Porque el NaOH interactúa con el CO2 del aire, provocando su carbonatación; esto disminuye gradualmente el pH alcalino necesario para desnaturalizar los componentes celulares
¿Cuál es la función de la centrifugación durante la extracción de ADN?
Separar componentes celulares según su densidad y facilitar la recuperación del ADN.
¿Qué función cumple el buffer de carga (buffer de carga + Red Gel) al mezclarlo con las muestras?
Aumenta la densidad de la muestra para que se hunda en el pozo, y el colorante permite visualizar el avance de la migración durante la electroforesis.
¿Qué tipo de muestras biológicas pueden procesarse con el kit ZymoBIOMICS según la práctica?
Cultivos bacterianos, tejidos y muestras ambientales, entre otras.
Durante la lisis alcalina, ¿por qué el ADN plasmídico se puede recuperar intacto mientras que el ADN cromosómico se desnaturaliza irreversiblemente?
Porque los plásmidos son pequeños y superenrollados, permitiendo que sus hebras se unan rápido al neutralizar el pH. El ADN cromosómico es muy grande y lineal, por ello se enreda y desnaturaliza irreversiblemente.
¿Cómo influye la concentración de agarosa (%) en la resolución y separación de los fragmentos de ADN en el gel?
A mayor concentración de agarosa, el tamaño del poro es más pequeño, lo que permite una mejor resolución y separación de fragmentos de ADN pequeños. Concentraciones bajas generan poros más grandes, ideales para separar fragmentos grandes de ADN
¿Por qué el paso por la columna Zymo-Spin acorta drásticamente el tiempo de purificación comparado con el método manual?
Porque reemplaza los pasos repetitivos de precipitación con isopropanol, lavados con etanol a diferentes concentraciones y las largas centrifugaciones para colectar pellets, reteniendo el ADN en un solo paso.
Un equipo midió en su bitácora la preparación de la muestra con: 1 microlitro de Buffer de Carga (con Red Gel) y 7 microlitros de ADN extraído. Si al revelar el gel la banda de ADN se ve extremadamente tenue casi invisible, pero el marcador de peso corrió perfecto, ¿qué error metodológico ocurrió?
El error estuvo en la concentración o calidad del ADN extraído (baja biomasa o pérdida del pellet), ya que el cóctel de carga y el Red Gel sí funcionaron correctamente en el carril del marcador.
Si estás extrayendo ADN de una bacteria Gram negativa en lugar de la Gram positiva de la práctica, ¿qué modificaciones químicas deberías hacer en la Solución I y por qué?
Agregar lisozima y aumentar el EDTA para degradar la membrana externa de la bacteria y evitar que los componentes celulares remanentes inhiban las enzimas en la PCR.
¿Qué compuesto químico se utiliza típicamente en el último paso para eluir el ADN de la matriz de sílice de la columna y por qué funciona?
Agua libre de DNasas/RNasas (o buffer de elución de bajo pH/sales). Funciona porque en ausencia de altas concentraciones de sales caotrópicas, las interacciones moleculares entre el ADN y la sílice se rompen, liberando el material genético purificado.
Imagina que preparas correctamente el gel, pero olvidas añadir el marcador de peso molecular. ¿Qué información importante perderías al analizar tus resultados?
No se podría estimar el tamaño aproximado de los fragmentos de ADN observados
¿Cuándo se debe detener la electroforesis según el protocolo de la práctica?
Cuando el colorante del buffer de carga esté a 1 cm de la orilla del gel del extremo opuesto al de los pozos (lado del ánodo)
Un equipo olvidó aplicar el vórtex estricto al pellet bacteriano tras añadir la Solución I, provocando que quedaran grumos compactos antes de poner la Solución II. ¿Qué impacto tendrá esto en la pureza y rendimiento final del ADN?
Provoca una lisis celular incompleta. Los reactivos de la Solución II (SDS/NaOH) no entran en contacto uniforme con las bacterias atrapadas en el centro del grumo, disminuyendo drásticamente el rendimiento de ADN y dejando restos celulares que contaminarán la muestra
Un hospital quiere implementar extracción de ADN bacteriano para diagnóstico rápido de infecciones. ¿Qué características del kit ZymoBIOMICS lo hacen o no lo hacen adecuado para este contexto?
A favor: rapidez (pocas horas), reproducibilidad, seguridad sin reactivos peligrosos, y compatibilidad con PCR diagnóstica. En contra: costo por muestra más elevado que métodos caseros y dependencia de proveedor
Se observa que las bandas del ADN extraído con el kit migran más rápido que el marcador de mayor tamaño, pero son difusas y sin forma definida. ¿Qué indica esto sobre la integridad del ADN?
El patrón indica degradación del ADN. El ADN íntegro de alto peso molecular migra poco y queda cerca del pozo; si migra rápido y de forma difusa, está fragmentado en fragmentos heterogéneos por posible actividad de nucleasas, calor excesivo o ciclos de congelación-descongelación repetidos.
Un alumno obtiene ADN con alto rendimiento pero en las corridas posteriores el PCR falla repetidamente. ¿Qué contaminante pudo haber quedado y en qué paso del kit se elimina?
Probablemente hay sales o proteínas residuales. Se eliminan en los pasos de lavado con Wash buffer 1 (400 µl) y Wash buffer 2 (700 µl + 200 µl) usando la columna Zymo-Spin IICR.