Fundamento teórico
¿Qué otro nombre se le da al patrón de difracción?
Transformada de Fourier
¿Por qué en la cristalización de macromoléculas no pueden usarse técnicas clásicas como evaporación de solvente?
Causan la desnaturalización de la proteína
¿Cuál es la función de un agente precipitante?
Reducir la solubilidad de una macromolécula.
¿Cuánto tarda la cristalización?
Puede tardar de horas a meses.
¿Qué variables se optimizan principalmente?
Concentración de agente precipitante, pH y temperatura.
¿Por qué se usan rayos X para determinar la estructura de moléculas en cristales?
La longitud de onda de los rayos X corresponde al largo promedio de enlaces.
¿Cómo se diferencia un cristal macromolecular de uno normal (ej. cuarzo)?
Los cristales macromoleculares son pequeños, suaves, frágiles, sensibles a la deshidratación y radiación y tienen una pobre difracción de rayos X. En el caso de los cristales de moléculas pequeñas es el opuesto.
¿Qué clases de agentes precipitantes existen (al menos 3)?
Sales, solventes orgánicos volátiles, polimeros de cadena larga y compuestos orgánicos no volátiles.
¿Por qué a veces se usan detergentes en la cristalización?
Para solubilizar proteínas relativamente hidrofóbicas (como las proteínas de membrana).
¿Qué otras modificaciones pueden llevarse a cabo si no se logra cristalizar la proteína modificando agente precipitante, temperatura o pH?
Uso de ligandos, detergentes y metales divalentes.
Mencione dos métodos que se utilizan para determinar el ángulo de fase en el análisis de cristalografía.
¿Cuáles son las fases de la sobresaturación?
Metaestable, lábil y precipitado
¿Cuál es el mecanismo de acción de los solventes orgánicos?
Los solventes orgánicos compiten por moléculas de agua (deshidratan) y reducen el apantallamiento dieléctrico (polaridad) del solvente.
¿Qué otras sustancias se añaden para preservar a la proteína durante la cristalización?
EDTA o EGTA, mercaptoetanol y azida de sodio o timol.
¿En qué fases se divide la optimización de cristalización?
1) Identificar las condiciones químicas, bioquímicas y físicas que favorecen la formación de cristal y 2) el afinamiento de las condiciones para la obtención de muestras ideales para análisis de cristalografía.
¿Cuál es el problema de fase?
El ángulo de fase correspondiente a cada intensidad del patrón de difracción de un cristal se requiere para la síntesis de Fourier, pero no puede determinarse directamente.
¿Por qué una sobresaturación excesiva no es deseable?
Porque provoca que se formen bastantes núcleos inestables que no crecen mucho y también se favorece la inclusión de contaminantes
¿Cuál es la ventaja del polietilenglicol sobre otros agentes precipitantes?
Las proteínas cristalizan bajo un rango estrecho de concentración 4-18%.
Explicar el mecanismo del método de diálisis.
La diálisis se basa en la alteración de la solución con proteína (licor madre) usando difusión a través de una membrana semipermeable que solo permite el paso de iones pequeños. Por lo tanto, se utiliza para alterar lentamente el pH y fuerza iónica del licor madre hasta inducir la cristalización.
¿Por qué es importante la pureza de la proteína en la cristalización?
La reducción en la contaminación contribuye a reducir la introducción de moléculas imperfectas que ralentizan el crecimiento del cristal y pueden comprometer su estabilidad estructural
¿Por qué se necesita preparar un cristal para estudiar la estructura de una molécula con esta técnica?
Un cristal amplifica la dispersión generada por cada molécula individual y permite que, a partir de las intensidades observadas, se deduzca el patrón de difracción de la molécula con suficiente resolución.
¿Por qué la presencia de solvente en el enrejado cristalino de una macromolécula puede ser una ventaja y desventaja a la vez?
Es una desventaja porque complica la cristalización de macromoléculas y causa que los cristales resultantes sean más débiles y menos ordenados. Es una ventaja porque permite que la macromolécula mantenga su estructura en solución y permite la realización de ensayos con sustratos, fármacos, etc.
¿Cuál es la ventaja de usar agentes precipitantes además de modificar el pH y temperatura?
¿Cuál es el fundamento de la difusión por vapor cuando hay un agente rpecipitante no volátil.
El vapor de agua entre gota y reservorio se equilibra cuando la concentración del agente en la gota se asemeja al del reservorio.
¿Cuándo se usa el proceso de "seeding?"
Cuando la nucleación y el crecimiento de cristales a un tamaño adecuado no puede llevarse a cabo en una misma solución porque las condiciones requeridas para ambos pasos son muy distintas.