Fundamentos de PCR
Cuál es la función principal de los "oligos" o cebadores en una reacción de PCR
Son secuencias cortas de ADN diseñadas específicamente para unirse a las regiones que flanquean la secuencia de interés, permitiendo que la ADN polimerasa comience la síntesis.
Razón principal por la cual el ARN es más difícil de manipular que el ADN.
El ARN es químicamente menos estable y susceptible a la degradación por enzimas ubicuas llamadas RNasas
Buffer utilizado específicamente para la electroforesis de ARN debido a su capacidad amortiguadora.
MOPS, mantiene la estabilidad del ARN en geles desnaturalizantes y evita su degradación
temperatura estándar utilizada para la desnaturalización inicial del ADN en el termociclador.
95°
¿Qué tipo de microorganismos se utilizan principalmente en la práctica de extracción de ARN descrita?
Bacterias gram negativas
Etapa del ciclo de PCR que ocurre a 94-98 °C para separar las hebras de ADN.
Desnaturalización
Enzimas presentes en el ambiente y en las manos que degradan rápidamente el ARN.
RNasas, son muy estables y no requieren cofactores lo que las hace difíciles de inactivar durante la extracción.
Buffer de corrida estándar utilizado para analizar productos de PCR de ADN.
Buffer TAE
Temperatura de extensión óptima para la polimerización del ADN por la Taq polimerasa.
72°c
Por qué se debe mantener la muestra en hielo durante el proceso de extracción de ARN
Para reducir la actividad enzimática de las RNasas y prevenir la degradación de la molécula.
Enzima termoestable utilizada para replicar el ADN en condiciones de alta temperatura.
Taq polimerasa
Material contenido en la columna DR del kit comercial que permite la unión selectiva del ARN.
Membrana de silice, permite que los ácidos nucleicos se unan en presencia de sales cao trópicas, facilitando su purificación y lavado.
¿Qué indica el coeficiente de absorción 260/280 en espectrofotometría respecto a una muestra de ácido nucleico?
El coeficiente 260/280 es una medida de pureza para ácidos nucleicos
Técnica utilizada para separar y visualizar fragmentos de ADN o ARN según su tamaño.
Electroforesis
Qué enzima se debe añadir en el protocolo de purificación para asegurar que el ARN no esté contaminado con ADN genómico?
ADNasa
Función principal de los dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato) en la mezcla de reacción.
Los dNTPs proporcionan los nucleótidos (A,T,C,G) necesarios para que la polimerasa sintetice las nuevas cadenas complementarias
Reactivo añadido para inactivar RNasas y desnaturalizar proteínas durante la lisis celular.
B-mercaptoetanol
¿Por qué es necesario agregar formaldehído al gel de agarosa para ARN?
porque el ARN es una molécula que forma estructuras secundarias (se pliega sobre sí misma). El formaldehído actúa rompiendo esos plegamientos para que la molécula se mantenga lineal.
¿Cuál es la finalidad de la etapa de "lavado" en las columnas de sílice antes de la elución final?
Eliminar sales, proteínas y otros contaminantes que no se unieron a la membrana de sílice
Qué diferencia esperas observar en un gel de agarosa si comparas una muestra de ADN después de la PCR frente a una muestra antes de la PCR
En la muestra sin amplificar (antes de PCR), no se observará una banda definida o será muy tenue debido a la baja concentración del fragmento específico. En la muestra amplificada (después de PCR), se observará una banda intensa y clara del tamaño esperado, debido a la producción exponencial de millones de copias.
Variable que define la temperatura de alineamiento y depende de la composición de bases de los oligos.
La Tm es crítica para determinar la temperatura de alineamiento, depende de la proporción de pares G-C frente a A-T
Buffer utilizado en el paso final para liberar el ARN purificado de la columna DR.
Buffer Re
¿Qué indica una banda borrosa (tipo "smear") en un gel de agarosa tras una extracción de ARN?
Indica degradación del ARN
Qué efecto tiene la presencia de etanol residual en la columna sobre la calidad del ácido nucleico eluido?
Puede inhibir reacciones enzimáticas posteriores (como la PCR)
¿Qué función tiene el b-mercaptoetanol en el protocolo de extracción?
Actúa como agente reductor para desnaturalizar proteínas y ayudar a inactivar las RNasas