E-frågor
1. Varför behöver man först höja temperaturen när man genomför PCR-metoden?
För att DNA-strängarna skall separeras (denaturering).
6. Vad gör en kloningsvektor?
Det är ofta en plasmid som bär över gener från en art till en annan, för att ”skapa” en transgen organism.
8. Beskriv utförligt hur PCR-metoden fungerar.
Först blandar man ut DNA-bufferten man vill amplifiera med primrar och DNA-polymeras från bakterien Thermus aquaticus. Blandningen värms upp för att få DNA att smälta så att vätebindningarna mellan kvävebaserna bryts. Eftersom DNA-polymeraset tagits från en värmetålig bakterier så fungerar fortfarande enzymet. Sedan kyls blandningen ner så att primrarna kan binda in till det enkelsträngade DNA:t (som nu tekniskt sett är RNA). Sist så höjer man temperaturen så att den blir optimal för DNA-polymeraset att arbeta, och elongeringen av 2 nya DNA-helixar börjar. Sedan upprepas processen flera gånger om.
12. Beskriv vad ett DNA-polymeras gör. Diskutera sedan varför man måste ta DNA-polymeras från den exotiska bakterien Thermus aquaticus för att kunna genomföra PCR-reaktioner? Hur hade PCR-processen gått om man istället använt polymeras från den vanliga bakterien E.Coli?
DNA-polymeras är ett enzym (ett polymeras) som är aktivt vid replikation av cellernas DNA, vilket är det första steget i celldelningen . Dess specifika uppgift är att påskynda sammanfogningen av nukleotider, DNA:s informationsbärare, med komplementära nukleotider på DNA-kedjans nukleotider (A–T, C–G).DNA-polymeras finns i alla levande organismer. Det finns dock inte i en del virus som har sitt igenom i form av RNA istället för DNA och därför bara använder sig av RNA-polymeras . I molekylärbiologiska och biokemiska laboratorier används ofta ett värmestabilt DNA-polymeras som kallas taq-polymeras. Detta enzym tillhör ursprungligen bakterien Thermus aquaticus som lever i varma källor, och vars beståndsdelar alltså är extremt värmetåliga. Upptäckten renderade det möjligt att effektivt kunna tillverka stora mängder av specifika DNA-sekvenser med hjälp av metoden PCR . Thermus aquaticus är en bakterie som lever och reproducerar sig vid temperaturer runt 100 C. Även hos denna bakterie finns ju DNA-polymeraser, och dessa polymeraser är så beskaffade att de inte förstörs vid de höga temperaturerna i sin naturliga miljö. Det innebär att de inte heller förstörs vid de höga temperaturer som krävs för att smälta DNA:t. Därför går det väldigt bra om man använder Taq till PCR-processen. PCR-processen hade inte gått lika bra om man istället använde polymeras från den vanliga bakterien E.coli Från början, när tekniken var ny, använde man sig av ett polymeras från bakterien E. coli. Detta var inte särskilt effektivt eftersom denatureringssteget, på grund av sin höga temperatur, inaktiverade polymeraset och nytt polymeras måste tillsätts i varje cykel, och det tar väldigt mycket tid. Man studerade bakterier som levde i varma källor med temperaturer runt 100 °C och fann en bakterie som frodas i dessa temperaturer, Thermus aquaticus. Från bakterien renades Taq polymeraset fram som utan svårigheter klarade denatureringssteget på 95 °C och var lika effektivt under alla cykler. Genom denna upptäckt lyckades man förenkla hela PCR genom att det tidsödande steget med att tillföra nytt polymeras togs bort. I och med att man bytte ut E. coli polymeraset mot Taq blev även säkerheten större med testerna. Användningsmöjligheterna ökade och man kunde nu t ex amplifiera längre och känsligare sekvenser.
2. Vad är primrarnas roll i PCR-reaktionen?
Att vara ”fästet” som alla nukleotider byggs på ifrån.
7. Förklara kort vad ett ”knock-out”-djur är.
Det är ett djur som saknar en eller flera gener i sitt DNA. De skapas i laboratorium.
9. Förklara utförligt vad en kloningsvektor är och hur den fungerar.
En kloningsvektor är vanligtvis en plasmid som bär på gener som skall klonas. Man för över kloningsvektorer från celler till bakterieodlingar för att föröka dem. Polylinkern är platsen i plasmiden där generna placeras som skall klonas. Här öppnas plasmiden upp av restriktionsenzymer och generna sätts in. Man har nu en plasmid med rekombinant DNA. Plasmiden sätts sedan med bakterier för att dessa ska ta upp kloningsvektorn via transformation. Ofta behöver man köld/värmechocka bakterierna så att deras cellhöljen öppnar sig för plasmiderna.
13. Beskriv hur insertionssekvenser och komplexa transposoner skiljer sig åt. Diskutera även vilken av dessa som varit viktig för evolutionen och ge utförliga exempel på hur den varit viktig.
Transporterbara (flyttningsbara) gener kalla transposoner eller även “hoppande gener” och finns i alla celler. Transposoner är gener som kan “hoppa” mellan olika platser i DNA:t. Sker ofta slumpmässigt och kalla för transposition. Det tror man är viktigt för evolutionens variation. Man skiljer på två olika typer av transposoner, insertionssekvenser eller enkla transposoner och komplexa transposoner. Insertionssekvenser innehåller bara de gener som just behövs för att förflytta transposoner. Generna består av någon form av transposon, samt eventuellt andra gener som kan hjälpa till vid transpositionen. De komplexa transponera innehåller samma gener som insertionssekvenser, men bär med sig ytterligare en eller fler gener. Hos bakterier kan dessa gener till exempel medföra antibiotikaresistens av något slag och därmed bidra till en ökad chans till överlevnad för organismen. Vilken av dessa två är viktigast? Jo, komplexa transposoner har varit viktigare för evolutionen, har extra gener på sig, de extra gener har lätt för mutationer, djuren (tex transgena djur), bakterier får sin antibiotika resistens tack vare dessa extra gener. Fortsätt här att diskutera fördelaktiga mutationer för något djur, ELLER hur bakterier m.h.a. komplexa transposoner har utvecklat antibiotikaresistens.
3. Vad gör ett restriktionsenzym?
Klipper ut DNA-sekvenser vid bestämda kodsekvenser (platser med kvävebaser)
10. Förklara hur selektiv utslagning av gener via homolog rekombination går till.
Genen är utformad så att en central del är ersatt med neo-genen, som ger resistens mot antibiotikumet neomycin. I ena änden av genen sätts dessutom tk-genen på, vilket ger känslighet för antibiotikumet gancyklovir. När vektorn överförts till ES-celler, kan den mutanta genen föras över till cellens genom, antingen genom icke-homolog rekombination (vanligt) eller homolog rekombination (ovanligt). Vid homologa rekombinationen ersätts den fungerande genen med en muterad gen. Vi får på så sätt en mutant cell. Vid den homologa rekombinationen går tk-genen förlorad. När dessa celler odlas i medium som innehåller både neomycin och gancyklovir överlever de, eftersom den mutanta genen innehåller resistens mot neomycin. Eftersom tk-genen inte längre finns med är cellen inte längre känslig för gancyklovir.
4. Vad innebär homolog rekombination?
Att samma gensekvens på 2 olika kromosomer byter plats med varandra.
11. Beskriv hur man använder en selektionsmarkör för att välja ut bara de celler som har tagit upp en plasmid.
En selektionsmarkör är ofta en eller flera antibiotikaresistensgener. Dessa sätts in i kloningsvektorn (beskriv här vad en kloningsvektor gör) som sedan sätts i bakterieodlingar. När bakterierna sedan fått växa till sig så behandlar man dem med antibiotika. De bakterier som överlever antibiotikabehandlingen har då bevisligen tagit upp plasmiderna som innehåller både det rekombinanta DNA:t man ska klona och antibiotikaresistensgenen. Selektionsmarkören har alltså markerat vilka av bakterierna man sedan kan jobba med.
5. Vad betyder det att en organism är transgen?
Den har fått en annan arts gener insatta i sitt DNA. Som den självlysande akvariefisken.