RNA polymerase
Processing 1
Splicing og spliceosomer
Eukaryoter
Prokaryoter
100
Er CCA sekvensen på 3'enden af tRNA enten: Kodet af DNA'et eller Tilføjet efter transkriptionen af en RNA polymerase
Tilføjet efter transkriptionen af en RNA polymerase, som jo desuden ikke kræver en template.
100
Hvad sker der med mRNA efter syntese af RNA polymerase i prokaryoter?
Der sker ingen, eller næsten ingen modifikation efter syntesen.
100
Hvad er konsensussekvenserne for 5' splicesite og 3' splicesite?
5' splicesite er GU 3' splicesite er AG. Bónus: Derudover så ses der et branchsite (20 til 50 nukleotider upstream fra 3' splicesite) og en pyrimidinetract (bestående af 10 pyrimidiner) efterfulgt af en vilkårlig base og så et C, og ender med 3' splicesitet AG.
100
Hvad hedder promotoren som ligger mellem -30 og -100 og er meget typisk for eukaryoter?
TATA-box
100
Hvad kaldes den subunit, som genkender -10 (pribnow box) og -35 (-35 region) promotorsekvenserne?
Sigma subunit. Bonus: Den normale sigmasubunit er sigma-70 og har til ansvar at gøre bindingen mellem RNA polymerase og promotorsites mulig. Sigma subunit genkender promotor gennem mange interaktioner med promotor DNA'ets baser. Når RNA kæden bliver 9-10 nukleotider lang, så frigøres sigma, og kan nu hjælpe til ved en ny initiering. E. Coli har 7 forskellige sigma-faktorer - en anden kommer i spil ved pludselige temperaturstigninger, det er sigma-32 som genkender promotore for heat-shock gener.
200
Hvor er hhv. RNA polymerase 1, 2 og 3 lokaliseret
RNA polymerase 1 ligger i nukleoli RNA polymerase 2 ligger i nukleoplasma RNA polymerase 3 ligger i nukleoplasma.
200
Hvad er RNA editing, og hvilke 2 mekanismer er grundlæggende?
RNA editing er ændring af nukleotidsekvensen af RNA efter dets syntese. Dermed kan proteinsekvensen ikke forudses på baggrund af gen-sekvensen. De 2 mekanismer er: Substitutions editing, som f.eks. er kemisk ændring af individuelle nukleotider (punktmutationer) eller ændring som er katalyseret af enzymer som genkender specifikke målsekvenser. Insertions/deletions-editing - dette medieres af guide RNA, som virker som en template for tilføjelse/fjernelse af nukleotider, og indeholder en poly(U)hale som donerer uridine-rester. Ved hjælp af dette kan antallet af proteiner tilgængelige øges uden at ændre antallet af gener i genomet. Proteiner med forskellige funktioner kan dannes under specielle forhold.
200
FORKERT PLACERET: Hvad gør de specifikke transkriptionsfaktorer
Da det basale transkriptionsapparat kun initierer transkription ved lav frekvens bruges specifikke transkriptionsfaktorer til at øge frekvensen hvormed mRNA syntetiseres. De kan selektivt stimulere transkription fra specifikke gen. De stimulatoriske sites er forskellige i sekvenser og varierer i position, og disse sites genkendes af de specifikke transkriptionsfaktorer.
200
Hvilke 2 andre typiske promotore ses længere upstream og virker som regulatoriske sekvenser.
CAAT box GC box Disse 2 kan også være effektive når de er beliggende på template strengen. Det specielle ved TATA, CAAT og GC samt andre cis-bindende elementer i eukaryoter er at de er genkendt af proteiner, som er forskellig fra RNA polymerasen.
200
Fortæl om de 2 promotor-sekvenser i prokaryoter, og forklar følgende: Hvor er placeringen? Hvad hedder de? Hvad er den mest ideelle afstand mellem dem?
De ligger på hhv. -10 og -35, hedder Pribnow box og -35 region og den mest ideelle afstand mellem dem er 17 baser, hvilket giver den stærkeste binding til sigma subunit, og derfor også den bedstmulige transkription. Bonus: -10 og -35 promotorsites er begge 6 nukleotider lange og de er skabt ud fra konsensussekvenser. -10 (Pribnow) har en konsensussekvens som ligner TATA boxen i eukaryoter, og er følgende: TATAAT. -35 regionen har følgende konsensussekvens: TTGACA. Jo mere præcis promotorsites svarer til konsensussekvenser, des stærkere binding og dermed mere effektiv transkription.
300
Hvilke 3 RNA polymeraser ses, hvilke cellulære transkripter dannes ved hjælp af disse og hvorvidt har alfa-amanitin en påvirkning på disse polymeraser
RNA polymerase 1 - danner 18S, 5.8S og 28S rRNA. Er ikke-sensitiv over for alfa-amanitin. RNA polymerase 2 - danner mRNA forstadier og snRNA - er meget inhiberet af alfa-amanitin. RNA polymerase 3 - danner tRNA og 5S rRNA, og er inhiberet af alfa-amanitin ved høj koncentration heraf.
300
Hvordan bliver tRNA og rRNA molekyler produceret?
Ud fra kløvning af et primært transkript via nukleaser. RNase P genererer alle 5' ender af alle tRNA molekyler RNase 3 udklipper alle rRNA fra forstadier ved at kløve en dobbelt-helisk hårnåle struktur ved specifikke sites, og dermed bliver 23S, 16S og 5S klippet ud. Imellem alle de 4 molekyler, hhv. tRNA samt 23S, 16S og 5S rRNA så ligger der såkaldte spacer-regioner.
300
Hvilke mulige splicings kan laves ved alternativ splicing?
Exon skipping/inkludering Alternativ 3' splicesites Alternativ 5' splicesite Gensidig exclusive exon Intron bevarelse
300
Hvad er en enhancer og hvad gør den?
Det er et cis-acting element, som ikke har nogen promotoraktivitet, men kan udøve deres stimulatoriske virkning over store distancer. Derudover kan de være upstream, downstream eller intragene, og kan dermed have begge orienteringer. De kontakter promotore via looping, og dens aktioner er medieret af specifikke transkriptionsfaktorer.
300
Hvor mange basepar af DNA er udsnoet i transkriptionsboblen, og hvor hurtigt bevæger transkriptionsboblen sig fremad?
Transkriptionsboblen består af 17 bp udsnoet DNA, og bevæger sig med 170 Å pr sekund (dvs. ca. 50 nukleotider pr. sekund). Bonus: RNA-DNA helix'en er 8 bp lang, hvilket passer til næsten 1 runde af en dobbelthelix. Alle baseparrene udover de 8 bp som er udsnoet (9 bp) ligger simpelthen for meget spredt fra hinanden til at de kan interagere med hydrogenbindinger. 3' OH gruppen er beliggende sådan, at den kan angribe alfa-fosfaten på et indkommende ribonukleosid trifosfat.
400
Hvordan er de forskellige promotore for hhv. RNA polymerase 1, 2 og 3.
RNA polymerase 1 har en UPE + ribosomal initiator som sammen udgør promotoren. RNA polymerase 2 består af en enhancer som er beliggende langt upstream, samt en promotor som kan variere men ofte enten indeholder en TATA-box og initiator element eller initiator element (ligger omkring -3 til +5) og DPE (ligger downstream for transkriptionsstart, omkring +28 til +32) RNA polymerase 3 - deles op i 2 typer, enten Type 1, som består af en A blok og C blok samt en Type 2, som består af en A blok og en B blok´. Det specielle for disse 2 er at promotorerne ligger intragene, dvs. downstream for transkriptionens startsted. Type 1 promotore bruges ved transkription af 5S rRNA og Type 2 promotore bruges ved transkription af alt tRNA.
400
Hvad er alternativ splicing og hvordan reguleres dette?
Alternativ splicing er en mekanisme som kan danne større protein-forskellighed ved at splice forskellige kombinationer af exons fra samme gen sammen. Alternativ splicing reguleres via trans-acting splicing faktorer til cis-acting sekvenser i præ-mRNA'et. Disse trans-acting splicing factors kan enten fungere som en aktivator (som binder til splicing enhancer) eller repressor (som binder til repressor site)
400
Forklar kemien bag splicing.
Det starter med at branchsite fra et intron's 2'OH angriber phosphodiesterbindingen mellem Exon 1 og 5' enden af et intron. En 2'-5' phosphodiesterbinding dannes nu, mellem branchsite og 5' terminal fosfat af intron. Dette kaldes en transesterificering. Adenylaten som binder til intronet binder også til 2 3'-5' phosphodiesterbindinger og udgør en forgrening. 3'OH af exon1 angriber nu phosphodiesterbindingen mellem intron og exon 2. Exon 1 og exon 2 sammenkobles, og intron'et frigives i lariat form. Her er altså sket den anden transesterificering.
400
Fortæl 3 fakta om TF2D
Mulige svar: 700 kDa Består bl.a. af et TATA-bindende protein på 30 kDa. Indeholder 8-10 TBP-associerede faktorer Komplekset er klart asymmetrisk, for at startsite og direktion af transkription kan bestemmes. TBP binder TATA boxen meget stærkt. Fleksibiliteten i AT DNA udnyttes, da den bøjer DNA'et og udvinder det.
400
Forklar de 2 mulige termineringssignaler, som ses i prokaryoters transkription
1) En stem-loop, bestående af en dobbelthelix struktur bestående af mange G-C basepar, da de er stærkest og hairpin, ofte bestående af en række Uracil'er i træk som er utroligt svag. RNA polymerasen pauser fordi den lige har syntetiseret en streng af RNA som folder sig op i en hårnøgle. Pausen i transkription pga. hårnåle-strukturen tillader den svagt bundne RNA til at dissociere fra DNA template og derefter væk fra enzymet. 2) Rho proteinet - Rho kan trække det nysyntetiserede RNA igennem dens hexamere struktur og prøver på at indhente RNA polymerasen, og når den når op til tarnskriptionsboblen virker den som en hexamér helikase, som kan afbryde alle basepar-bindinger mellem RNA-DNA hybriden på sin vej. Bonus: Rho genkender ekstra termineringssignaler som ikke genkendes af RNA polymerasen selv. Den hydrolyserer desuden ATP ved tilstede værelse af enkelt-strenget RNA, men ikke DNA eller RNA duplex. Rho startes desuden af sekvenser som er rige på cytosin og fattige på guanin.
500
Forklar funktionen af RNA polymerase 2's carboxyl-terminal domæne (CTD)
Det består af gentagne YSPTSPS sekvenser, og S2 eller/og S5 kan fosforyleres/defosforyleres af kinaser/fosfataser hvilket ændrer på hvorvidt CTD domænet er aktivt eller inaktivt. Fosforylering af CTD kan ske via TF2H, som signallerer overgangen fra initiering til elongering. Denne fosforylerede CTD er nu involveret i rekruttering af: Capping enzymer (som methylerer 5' guanin på præ-mRNA lige efter transkriptionsstart), komponenter af splicing maskineriet (initierer udklipning af hver intron) og en endonuklease som kløver transkriptet ved poly(A) tilføjelses sitet og danner en fri 3'OH som er mål for adenylering. CTD er desuden defosforyleret under dannelse af det basale transkriptionsapparat.
500
Hvordan bliver cap 0 lavet?
5' trifosfatenden af det nysyntetiserede RNA bliver modificeret: En fosfatgruppe frigøres ved hydrolyse Difosfat 5' angriber nu alfa-fosfat på GTP for at danne en 5'-5' trifosfatbinding - kaldes nu for "cap". N-7 nitrogenet fra den terminale guanine bliver nu methyleret af S-adenosylmethionine. Bonus: Caps hjælper til stabiliteten af mRNA ved at beskytte den fra nukleaser og fosfataser. Derudover så er den også essentiel for translationsinitiering, da initieringsfaktoren eIF-4E binder hertil og hjælper det store PIC kompleks (43S preinitiation komplex) at sætte sig på. Poly(A) halens rolle er stabilitet og translation, da nogle mRNA er gemt uden at få påsat halen, og så kan de senere blive aktiveret ved at få sat poly(A) halen på, derudover hjælper den jo også til at PABP1 kan binde til og dermed lave cirkularisering at mRNA'et, hvilket også er essentiel for translationen.
500
Hvilke 5 snRNAs (på under 300 nukleotider) udgør spliceosomet, og hvad er hver deres funktion?
U1 snRNA - indeholder en 6-nukleotid sekvens, som ikke er beskyttet af protein og kan derfor baseparre med 5' splicesitet af præ-mRNA. Denne binding initierer samlingen af spliceosomet. U2 snRNA - bindes til branch-site i intron med baseparring, og denne binding kræver ATP hydrolyse. U4-U5-U6 udgør et forsamlet kompleks, som binder til U1, U2 og mRNA for at danne spliceosomet. U5 interagerer med exonsekvensen i 5' splicesitet og derefter med 3' exon. U6 - fjerner sig fra U4 og undergår nu intramolekylær rearrangeringer som tillader baseparring med U2 samt med 5' intron, hvilket fører til at U1 fjerner sig. Bonus: snRNA'ernes sekundære strukturer er ens fra gær til mennesker, og er associeret med specifikke proteiner kaldet snRNPs. U2 og U6 laver nogle RNA helicer, som bliver udvundet af ATP-drevne helikaser og dette fører til frigørelsen af snRNPs fra mRNA.
500
I hvilke steps samles det basale transkriptionsapparat?
En lang række transkriptionsfaktorer binder i følgende rækkefølge: D, A, B, F+RNA pol 2, E og H Bonus: TF2D indeholder et TATA bindende protein, som starter initieringen ved at binde til TATA-boxen til den konkave side af TBP (som er saddelformet). Binding fører til stor konformationsændring i det bundne DNA og dobbelthelixen udsnoes som gør minor groove bredere, og tillader den at lave en stærkere/bedre kontakt med det antiparallele beta-streng på den konkave side af TBP og her er hydrofobe interaktioner ret prominente. TBP sadlen er koblingssted for ekstra transkriptionsfaktorer, som sættes på i ovenstående rækkefølge. Under dannelse af det basale transkriptionsapparat, er CTP defosforyleret, men efter dannelsen bliver CTP fosforyleret og stabiliserer transkriptions elongering ved RNA polymerase 2
500
Hvilke subunits består RNA polymerasen af, og hvilken subunit binder til Upstream elementet (en række gener som udtrykkes i høj grad og som ligger 40-60 nukleotider upstream fra transkriptions sitet)?
RNA polymerasen består af 5 subunits: Alfa_2, Beta, Beta' og omega. UP-elementet er bundet af alfa-subunit af RNA polymerasen og disse UP-elementer øger effektiviteten af transkriptionen ved at danne et ekstra interaktionssite for polymerasen.
M
e
n
u