Estructura y mecanismos
¿Qué tipo de reacciones aceleran las enzimas?
Espontáneas.
¿En qué se unidad mide la actividad enzimática? Explique.
Se mide en Unidades Internacionales (UI). Son umoles de S (o P) transformados/generados por minuto.
¿Cómo seguimos el avance de una reacción catalizada por una enzima en el laboratorio?
Seguimos la aparición/desaparición de color en el tiempo utilizando el espectrofotómetro.
¿Cuál es la diferencia entre regular la concentración de la enzima y regular su actividad?
Concentración: Varía la cantidad de enzima disponible para la catálisis.
Actividad: No varía la cantidad de enzima disponible, pero sí qué tan activa está.
¿Qué tipo de interacciones predominan entre enzima y sustrato durante la formación del complejo ES?
Interacciones débiles (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, interacciones electroestáticas, interacciones hidrofóbicas).
Describa qué es la energía de activación y el efecto que tienen las enzimas sobre la misma.
Es la diferencia de energía entre la energía libre de los reactivos y la energía libre del estado de transición. Las enzimas la disminuyen estabilizando al estado de transición inestable.
Nombre las tres formas de obtener los parámetros cinéticos de una reacción a partir de los datos experimentales.
- Ajuste no lineal.
- Linealización de Lineweaver-Burk.
- Linealización de Eadie-Hofstee.
Explique cómo varía la actividad enzimática en función de la temperatura, con fundamentos.
A medida que aumenta la T aumenta la energía cinética de las moléculas de acuerdo a la ecuación de Arrhenius, por lo que aumenta la actividad, pero luego de la T óptima la enzima se desnaturaliza y queda inactiva.
¿Cómo se encuentran los AA que conforman el sitio activo a nivel de estructura primaria?
Distantes. El sitio activo se conforma por el plegamiento tridimensional de esa cadena, que los acerca en el espacio.
Nombre 3 razones por las que se forma una meseta en la gráfica de [P] en función del t.
- Se acabó el S.
- La enzima perdió actividad.
- Inhibición por P.
- Reacción inversa.
¿Cómo determinaría la T óptima de la reacción catalizada enzimáticamente?
- Experimento hasta determinación de Vo
- Repetirlo tantas veces como cantidad de T se quiera ensayar.
- Graficar Vo vs T.
- Encontrar la T correspondiente al máximo de actividad.
¿Qué parámetro cinético se ve afectado cuando cambia el estado de ionización de los grupos del sustrato?
Km: se ve afectado el reconocimiento E - S.
"Porción proteica de la enzima, carente de actividad catalítica."
Apoenzima.
¿Qué es km? Nombre, definición, y qué implica que sea alta o baja.
Km es la constante de afinidad de una enzima por un sustrato. Es la concentración de sustrato a la que la velocidad es la mitad de Vmáx.
Cuanto más baja es km, mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato.
¿Cómo obtendría la hipérbola michaeliana para una reacción catalizada enzimáticamente?
- Colocar E, S y buffer en cubeta.
- Medir absorbancia en el tiempo a la longitud de onda del compuesto coloreado.
- Dividir la pendiente entre épsilon . l para obtener la Vo para esa [S].
- Repetir el experimento tantas veces como [S] se quiera ensayar.
- Graficar Vo vs [S]
¿Cómo se ve una inhibición mixta al aumentar la concentración del inhibidor y linealizar por Lineweaver-Burk?
Varían Vmáx y km de forma despropocional entre ellos, no son paralelas.
¿En qué se diferencian el modelo llave-cerradura y el modelo de ajuste inducido?
Llave-cerradura: El sitio activo es rígido. Se requiere complementariedad del sitio activo y el S libre.
Ajuste inducido: El sitio activo es flexible; se ajusta al sustrato tras la unión, el sustrato puede ajustarse también.
¿Cuál es la ecuación de Michaelis y Menten?
Vo = Vmáx.[S] / km + [S]
¿Cómo determinaría el valor de los parámetros michaelianos para su reacción enzimática? (lab + procesamiento de datos)
*Recordar que los parámetros michaelianos son los de la ecuación de Michaelis-Menten, por lo que la pregunta se refiere a km y Vmáx.
- Experimento hasta determinación de Vo (explicar).
- Repetirlo tantas veces como cantidad de [S] se quiera ensayar.
- Realizar ajuste no lineal mediante programa o realizar alguna de las dos linealizaciones (mencionar cuál).
- Obtener el valor de km y Vmáx.
Tiene una molécula en el laboratorio que sospecha que es un inhibidor. ¿Qué experimentos haría para determinar si lo es, y de qué tipo?
- Todo el experimento hasta llegar a Vo en ausencia de inhibidor.
- Repetir para distintas [S].
- Graficar linealización de Lineweaver-Burk.
- Repetir los 3 pasos anteriores para distintas concentraciones de inhibidor.
- Comparar rectas.
sin inihibidor y con distintas concentraciones de inhibidor.