Historie & Chemie der Nukleinsäuren (BPE 1.1 & 1.2)
Erläutern Sie das Transformationsexperiment von Avery et al. Welche biomolekulare Erkenntnis brachte es im Vergleich zu Griffith?
Griffith zeigte vorab, dass harmlose R-Zellen durch Rückstände abgetöteter, virulenter S-Zellen genetisch transformiert werden können. Avery identifizierte den transformierenden Stoff. Er spaltete die S-Zell-Rückstände in Fraktionen auf und behandelte sie mit spezifischen Enzymen: Proteasen (baut Proteine ab), RNasen (baut RNA ab) und DNasen (baut DNA ab). Nur beim Abbau der DNA durch DNasen blieb die Transformation der R-Zellen aus. Erkenntnis: Nicht Proteine oder RNA, sondern die DNA ist der Träger der genetischen Information.
Zeichnen Sie die allgemeine Strukturformel einer Peptidbindung (Kondensationsreaktion zweier Aminosäuren) und markieren Sie das Peptidrückgrat.
Eine Peptidbindung entsteht durch eine Kondensationsreaktion, bei der die α-Carboxylgruppe (−COOH) einer Aminosäure mit der α-Aminogruppe (−NH2) einer zweiten Aminosäure unter Abspaltung von Wasser (H2O) reagiert. Die Bindungsgruppe lautet −CO−NH−. Das Peptidrückgrat besteht aus der sich wiederholenden Abfolge von ⋯−N−Cα−C−… Atomen, von denen die variablen Aminosäure-Seitenketten (R) abzweigen.
Was unterscheidet bezüglich der Fragmentenden glatte Enden (Blunt Ends) von überhängenden Enden (Sticky Ends) nach einem Restriktionsverdau?
Typ-II-Restriktionsendonukleasen schneiden doppelsträngige DNA hochspezifisch an palindromischen Erkennungssequenzen.
Sticky Ends (überhängende Enden): Das Enzym schneidet die beiden DNA-Stränge versetzt (asymmetrisch). Es entstehen einsträngige Überhänge, die leicht wieder komplementäre Wasserstoffbrücken ausbilden können, was die Ligation hocheffizient macht.
Blunt Ends (glatte Enden): Das Enzym schneidet beide Stränge auf gleicher Höhe (symmetrisch). Es entstehen keine Überhänge. Die Ligation ist weniger effizient, bietet aber den Vorteil, dass alle glatten Enden unabhängig von der Sequenz miteinander verknüpft werden können.
Erklären Sie die Struktur-Funktionsbeziehung eines Antikörpers anhand der Begriffe Epitop und Paratop.
Ein Antikörper (Immunglobulin) besitzt eine Y-förmige Struktur aus zwei schweren und zwei leichten Polypeptidketten. Die Erkennung läuft hochspezifisch nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip ab: Das Paratop ist die hochvariable Region an den beiden Spitzen des Y-Antikörpers. Das Epitop ist der spezifische Oberflächenbereich (die Antigen-Determinante) auf dem Antigen, an den das Paratop über nicht-kovalente Wechselwirkungen passgenau bindet.
Welche Anforderungen müssen beim Primerdesign erfüllt sein, um Dimerenbildung und unspezifische Sekundärstrukturen zu vermeiden?
Gute PCR-Primer müssen folgende Kriterien erfüllen, um Fehl-Amplifikationen zu vermeiden:
Länge: Optimal sind 18–25 Nukleotide für eine ausreichende Spezifität.
GC-Gehalt: Sollte zwischen 40–60 % liegen, um eine stabile Bindung zu garantieren.
Schmelztemperatur (Tm): Beide Primer (Vorwärts und Rückwärts) müssen eine annähernd identische Schmelztemperatur aufweisen (ΔTm<2∘C).
Keine Haarnadelstrukturen (Hairpins): Keine komplementären Bereiche innerhalb eines Primers, da er sonst mit sich selbst hybridisiert.
Keine Primer-Dimere: Die Primer dürfen an ihren 3'-Enden nicht zueinander komplementär sein, da sie sich sonst gegenseitig amplifizieren.
Skizzieren Sie den chemischen Aufbau eines dNTP-Bausteins in Strukturformelschreibweise (inklusive Benennung der Bindungstypen: N-glykosidisch, Phosphodiester).
Ein dNTP (Desoxyribonukleosidtriphosphat) besteht aus drei Komponenten:
Eine Zucker-Komponente (Desoxyribose), die am C2'-Atom nur ein Wasserstoffatom (−H) statt einer Hydroxylgruppe (−OH) besitzt.
Eine organische Base (A, T, G oder C), die am C1'-Atom des Zuckers über eine N-glykosidische Bindungverknüpft ist.
Drei Phosphatreste am C5'-Atom, die über eine Esterbindung an den Zucker und untereinander über energiereiche Phosphoranhydridbindungen verknüpft sind.
Erklären Sie den Unterschied zwischen der α-Helix und dem β-Faltblatt auf Ebene der Sekundärstruktur. Welche chemischen Wechselwirkungen stabilisieren diese Strukturen an welchen Atomen?
Beide sind Formen der Sekundärstruktur von Proteinen, die ausschließlich durch Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb des Peptidrückgrats stabilisiert werden – die Seitenketten sind daran nicht beteiligt.
α-Helix: Das Rückgrat ist schraubig aufgewunden. Die Wasserstoffbrücken bilden sich intrakatenar (innerhalb desselben Strangs) zwischen dem Carbonyl-Sauerstoff (−C=O) einer Peptidbindung und dem Amid-Wasserstoff (−NH−) der viertnächsten Aminosäure aus.
β-Faltblatt: Mehrere Abschnitte des Peptidrückgrats liegen gestreckt längsseits nebeneinander (parallel oder antiparallel). Die Wasserstoffbrücken bilden sich interkatenar zwischen den nebeneinanderliegenden Strängen aus.
Beschreiben Sie die Funktionsweise der Blau-Weiß-Selektion mithilfe des Plasmids pUC18, des Substrats X-Gal und dem Indikator-Gen lacZ.
Die Blau-Weiß-Selektion dient dem Nachweis, ob ein Fremdgen erfolgreich in ein Plasmid cloniert wurde. Das Vektor-Plasmid pUC18 trägt das lacZ-Gen, welches für das Enzym β-Galactosidase codiert; mitten in diesem Gen liegt die Multiple Cloning Site (MCS).
Weiße Kolonien (Erfolg): Das Fremdgen wurde erfolgreich in die MCS ligiert. Dadurch wird das lacZ-Gen unterbrochen (Insertionsinaktivierung). Es wird keine funktionelle β-Galactosidase gebildet, das künstliche Substrat X-Gal im Nährboden wird nicht gespalten, die Kolonie bleibt weiß.
Blaue Kolonien (Misserfolg): Das Gen wurde nicht eingebaut (Religierung des Plasmids). lacZ ist intakt, das Enzym wird gebildet, spaltet X-Gal zu einem blauen Farbstoff.
Beschreiben Sie den molekularen Ablauf eines Sandwich-ELISA zum Nachweis eines spezifischen Antigens (inklusive der nötigen Waschschritte).
Der Sandwich-ELISA dient der quantitativen Bestimmung eines Antigens in einer Probe:
Coating: Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte sind mit einem spezifischen Fang-Antikörper (Capture Antibody) beschichtet.
Probenzugabe: Die antigenhaltige Lösung wird dazugegeben; das Antigen bindet an den Fang-Antikörper. Waschschritt entfernt ungebundene Reste.
Detektion: Ein zweiter, Enzym-gekoppelter Detektions-Antikörper wird zugegeben, der an ein anderes Epitop desselben Antigens bindet (das Antigen ist wie in einem Sandwich gefangen). Erneuter Waschschritt entfernt überschüssigen Detektions-Antikörper.
Substratzugabe: Ein farbloses Substrat wird zugegeben. Das gekoppelte Enzym setzt dieses in ein farbiges Produkt um. Die Intensität der Färbung (gemessen im Photometer) ist direkt proportional zur Antigenkonzentration.
Erläutern Sie das Prinzip der reversen Transkription zur Herstellung von cDNA. Warum ist cDNA zwingend notwendig, wenn man ein menschliches Gen in Bakterien exprimieren will?
Menschliche Gene enthalten Introns (nicht-codierende Bereiche) und Exons (codierende Bereiche). Bakterien besitzen kein Spleißosom und können Introns nicht aus der prä-mRNA herausschneiden. Würde man die genomische menschliche DNA direkt in E. coli einschleusen, würden die Introns mittranslatiert – das Protein wäre völlig fehlerhaft und funktionslos. Lösung: Man isoliert aus menschlichem Gewebe die bereits fertig gespleißte, reife mRNA (die nur noch Exons enthält). Das Enzym Reverse Transkriptase (eine RNA-abhängige DNA-Polymerase) schreibt diese mRNA in einen komplementären DNA-Einzelstrang um, der nach Vervollständigung zum Doppelstrang als cDNA (complementary DNA) bezeichnet wird. Diese cDNA enthält keine Introns mehr und kann von Bakterien fehlerfrei exprimiert werden.
Erklären Sie das Hershey-Chase-Experiment. Wie halfen die Isotope 32P und 35S dabei, die Proteine von der DNA funktionell zu trennen?
Hershey und Chase bewiesen die Trägerfunktion der DNA mithilfe von T2-Bakteriophagen und radioaktiver Markierung. Sie markierten die Phagen-Proteinhülle mit dem Isotop 35S (Schwefel kommt in Aminosäuren vor, nicht in DNA) und die Phagen-DNA mit 32P (Phosphor kommt in der DNA vor, nicht in Proteinen). Nach der Infektion von E. coli wurden die leeren Phagenhüllen im Mixer von den Bakterien abgeschüttelt. Ergebnis: Die Radioaktivität von 32P (DNA) befand sich im Bakterien-Sediment, während 35S (Proteine) im Überstand blieb. Die Phagen-DNA dringt also in die Zelle ein und steuert die Vermehrung.
Beschreiben Sie das A-P-E-Modell eines Ribosoms während der Elongationsphase der Translation. Welche Aufgaben haben die drei Bindungsstellen?
Während der Elongation wandert die mRNA durch das Ribosom, welches drei tRNA-Bindungsstellen besitzt:
A-Stelle (Aminoacyl-Stelle): Hier bindet die neu ankommende, mit einer Aminosäure beladene tRNA, deren Anticodon komplementär zum mRNA-Codon passt.
P-Stelle (Peptidyl-Stelle): Hier sitzt die tRNA, die die wachsende Peptidkette trägt. Das Ribosom knüpft hier die neue Peptidbindung (Peptidyltransferase-Aktivität).
E-Stelle (Exit-Stelle): Hierhin rückt die „entladene“ tRNA weiter, nachdem die Aminosäure auf die Kette übertragen wurde, und verlässt das Ribosom.
Vergleichen Sie die physikalischen Gentransfer-Methoden Hitzeschock (CaCl2) und Elektroporation hinsichtlich ihres Mechanismus bei E. coli.
eide Methoden bezwecken, die Zellwand und die hydrophobe Plasmamembran für DNA-Plasmide temporär durchlässig (kompetent) zu machen.
Hitzeschock (CaCl2): Die Zellen werden mit eiskalter Calciumchlorid-Lösung behandelt. Die Ca2+-Ionen maskieren die negativen Ladungen der DNA und der Membranphosphate, sodass sie sich nicht mehr abstoßen. Ein plötzlicher Temperaturschock (42∘C) erzeugt einen thermischen Flüssigkeitsstrom durch die Membran, der die DNA ins Innere reißt.
Elektroporation: Die Zellen werden einem ultrakurzen, hochfrequenten elektrischen Puls ausgesetzt. Das elektrische Feld polarisiert die Membranlipide, wodurch sich temporär mikroskopisch kleine Poren („Elektroporen“) bilden, durch die das Plasmid hineindiffundieren kann.
Proteine werden vor einer diskontinuierlichen SDS-PAGE mit SDS und 2-Sulfanylethanol (β-Mercaptoethanol) behandelt. Erläutern Sie die Wirkung dieser Substanzen auf molekularer Ebene.
Damit Proteine in der Gelelektrophorese rein nach ihrer Molekülmasse aufgetrennt werden, müssen Ladung und Form vereinheitlicht werden:
SDS (Natriumdodecylsulfat): Ist ein anisotropes, negatives Detergens. Es lagert sich in konstanter Menge an das Peptidrückgrat an, entfaltet das Protein und überdeckt die inhärente Eigenladung des Proteins vollständig mit einer gleichmäßig verteilten negativen Ladung. Alle Proteine haben nun das gleiche Ladungs-Masse-Verhältnis und wandern rein nach ihrer Größe zum Pluspol.
2-Sulfanylethanol (β-Mercaptoethanol): Ist ein Reduktionsmittel. Es spaltet kovalente Disulfidbrückenzwischen Cystein-Resten. Nur so können Proteinkomplexe (Quartärstrukturen) vollständig in einzelne, lineare Peptidketten zerlegt werden.
Berechnen Sie die theoretische Schmelztemperatur (Tm) für folgenden PCR-Primer mithilfe der Wallace-Regel (4+2-Regel): 5'- GGC TAA TCC GAT TTA GCG GC -3'.
Berechnung der Schmelztemperatur (Tm) nach der Wallace-Regel
(Der Schüler schreibt den Primer an die Tafel und zählt aus)
Antwort: Die Wallace-Regel zur Abschätzung der Schmelztemperatur für Primer bis zu einer Länge von 20 Basen lautet:
Auszählung des Primers 5'- GGC TAA TCC GAT TTA GCG GC -3':
Adenin (A) = 3
Thymin (T) = 4
Guanin (G) = 6
Cytosin (C) = 7
Gesamtlänge = 20 Basen.
Berechnung:
Die theoretische Schmelztemperatur des Primers beträgt 66∘C.
Was versteht man unter der Chargaff-Regel und wie beeinflusst das Verhältnis von G-C- zu A-T-Paaren die Schmelztemperatur (Tm) der DNA bei der Denaturierung?
Die Chargaff-Regel besagt, dass in doppelsträngiger DNA die Menge an Adenin gleich Thymin (A=T) und die Menge an Guanin gleich Cytosin (G=C) ist. Das Verhältnis beeinflusst die Stabilität der DNA fundamental: Zwischen A und T bilden sich zwei Wasserstoffbrückenbindungen aus, zwischen G und C jedoch drei Wasserstoffbrückenbindungen. Je höher der G-C-Anteil einer DNA-Sequenz ist, desto mehr Energie (Hitze) ist nötig, um die Stränge bei der Denaturierung zu trennen. Die Schmelztemperatur (Tm) steigt folglich linear mit dem G-C-Gehalt.
Nennen Sie die Ursachen und molekularen Vorgänge bei der Proteindenaturierung (z. B. durch Hitze, extreme pH-Werte oder Schwermetallionen). Was passiert dabei mit den Strukturebenen?
Bei der Denaturierung verliert ein Protein seine native, dreidimensionale Raumstruktur (Tertiär-, Quartär- und Sekundärstruktur) und damit seine biologische Funktion; die kovalente Primärstruktur (Aminosäuresequenz) bleibt intakt.
Hitze: Schwingungen brechen schwache hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken auf.
Extreme pH-Werte: Ändern den Ladungszustand der Aminosäure-Seitenketten, wodurch ionische Wechselwirkungen (Salzbrücken) zerstört werden.
Schwermetalle: Binden an Sulfhydrylgruppen (−SH) und zerstören so stabilisierende Disulfidbrücken.
Für die Expression in Pflanzenzellen nutzt man das Ti-Plasmid. Erklären Sie den natürlichen Ursprung dieses Vektors und wie er als Werkzeug im Gentransfer genutzt wird.
Das Ti-Plasmid (Tumor-inducing) stammt natürlicherweise aus dem bodenbewohnenden Bakterium Agrobacterium tumefaciens. Im Labor nutzt man es als Vektor für den Pflanzentransfers: Das Bakterium schleust einen spezifischen Teil des Plasmids, die T-DNA, stabil in das Kern-Genom der Pflanzenzelle ein. Für die Biotechnologie baut man die tumorinduzierenden Gene aus der T-DNA aus („disarmed“) und ersetzt sie durch das gewünschte Nutzgen sowie ein Selektionsmarker-Gen. Die manipulierten Agrobakterien infizieren Pflanzengewebe und übertragen das Gen stabil.
Erklären Sie die Funktionsweise des Western-Blots ab dem Zeitpunkt nach der Elektrophorese (Transfer, Blockierung, primäre/sekundäre Antikörper, Detektion via HRP/Luminol).
Der Western-Blot dient dem spezifischen Nachweis eines Proteins aus einem Proteingemisch:
Transfer (Blotting): Die in einer SDS-PAGE aufgetrennten Proteine werden mittels elektrischen Felds senkrecht aus dem Gel auf eine stabile Membran (z. B. Nitrozellulose) übertragen.
Blockierung: Freie Bindungsstellen auf der Membran werden mit unspezifischen Proteinen (z. B. Milchpulver) abgesättigt, um unspezifische Antikörperbindungen (Hintergrundrauschen) zu verhindern.
Antikörper-Inkubation: Die Membran wird mit dem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch an das Zielprotein bindet. Nach dem Waschen bindet ein sekundärer Antikörper an den konstanten Teil des primären Antikörpers. Dieser Sekundärantikörper trägt ein Enzym (z. B. Meerrettichperoxidase, HRP).
Detektion: Zugabe von Luminol/Substrat führt zu einer Chemilumineszenz-Reaktion exakt am Ort des Zielproteins, die auf einem Film oder per Kamera dokumentiert wird.
Benennen Sie mindestens fünf Kernbestandteile eines klassischen Rührkesselbioreaktors und erklären Sie deren Funktion zur Aufrechterhaltung der Homogenität im System.
Um die Homogenität (konstante Verteilung von Nährstoffen, Sauerstoff und Temperatur) zu sichern, verfügt der Rührkesselreaktor über folgende Kernkomponenten:
Rührwelle mit Impeller (z. B. Rushton-Turbine): Sorgt für die mechanische Durchmischung des Mediums und das Zerschlagen von Gasblasen zur Vergrößerung der Phasengrenzfläche.
Strombrecher (Baffles): An den Innenwänden angebrachte Bleche, die das Mitrotieren der Flüssigkeit verhindern und die Kreisströmung in turbulente vertikale Strömungen umwandeln (Vermeidung von Trombenbildung).
Begasungsring (Sparger): Sitzt am Boden unter dem Rührer; leitet sterile Luft oder reinen Sauerstoff in Form von Blasen in das System ein.
Thermomantel/Kühlungs-Doppelmantel: Führt Wärme ab (Fermentationswärme und Reibungswärme) oder führt sie zu, um die optimale Temperatur konstant zu halten.
Messsonden (pH, pO2, Temperatur): Erfassen permanent die Prozessparameter, um über automatische Zudosierung von Säure/Base oder Substrat (Fed-Batch) das System im Optimum zu halten.
Beschreiben Sie das Prinzip der DNA-Modifikation durch Methylierung an CpG-Islands sowie Histonmodifikationen und ordnen Sie diese dem Fachgebiet der Epigenetik zu.
Die Epigenetik beschreibt vererbbare Änderungen der Genaktivität, die nicht auf einer Änderung der DNA-Basensequenz beruhen.
DNA-Methylierung: Enzyme (Methyltransferasen) hängen Methylgruppen (−CH3) an Cytosin-Basen, meist innerhalb von Genpromotoren (CpG-Islands). Dies führt zur Chromatinkondensation und blockiert die Transkription (Gen-Silencing).
Histonmodifikation: Durch Acetylierung (Anhängen von Acetylgruppen) an Histonschwänzen lockert sich die Bindung zwischen der negativ geladenen DNA und den Histonen (Euchromatin). Dies macht die DNA für die RNA-Polymerase zugänglich und aktiviert das Gen.
Proteine wie EPO oder Insulin benötigen posttranslationalen Feinschliff. Erklären Sie die Mechanismen der N- und O-Glykosylierung sowie die Proteolyse von Proproteinen.
Nach der Translation am Ribosom müssen viele Proteine funktionalisiert werden:
Glykosylierung: Das kovalente Anhängen von Zuckerketten. Bei der N-Glykosylierung erfolgt dies im ER an der Amidgruppe von Asparagin. Bei der O-Glykosylierung im Golgi-Apparat an der Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin. Wichtig für die Stabilität und Löslichkeit (z. B. bei EPO).
Proteolyse: Das gezielte Herausschneiden von Peptidabschnitten. Insulin wird als inaktives Proinsulinsynthetisiert. Erst durch das Herausschneiden des innenliegenden C-Peptids durch Proteasen entsteht das aktive, zweikettige Insulin (A- und B-Kette), das über Disulfidbrücken zusammengehalten wird.
Skizzieren Sie den Aufbau und die biologische Funktion des immunologischen Abwehrsystems CRISPR/Cas9 in Bakterien (Nutzen Sie: Repeat, Spacer, guide-RNA, Cas-Proteine).
CRISPR/Cas9 ist das adaptive Immunsystem von Bakterien gegen Phagen.
Im Bakteriengenom befinden sich kurze Phagen-DNA-Abschnitte (Spacer), getrennt durch Wiederholungssequenzen (Repeats).
Bei einer erneuten Infektion wird dieser Bereich in die CRISPR-RNA (crRNA) transkribiert und bildet mit einer weiteren RNA die guide-RNA (gRNA).
Die gRNA leitet das Endonuklease-Enzym Cas9 präzise über Basenpaarung zur Zielsequenz der eindringenden Phagen-DNA. Cas9 führt dort einen hochpräzisen Doppelstrangbruch durch und setzt die Phagen-DNA außer Gefecht. In der Biotechnologie nutzt man eine künstliche gRNA, um jedes beliebige Gen an einer Wunschstelle zu schneiden (Gen-Editing).
Was versteht man bei einer quantitativen PCR (qPCR) unter dem CT-Wert (Threshold Cycle) und wie läuft eine absolute Quantifizierung mittels Standardkurve ab?
Die qPCR misst die Amplifikation der DNA in Echtzeit während der PCR-Zyklen über Fluoreszenzsignale.
CT-Wert (Threshold Cycle): Ist derjenige PCR-Zyklus, bei dem das Fluoreszenzsignal zum ersten Mal signifikant über das Hintergrundrauschen ansteigt und die exponentielle Phase beginnt. Je mehr Ziel-DNA zu Beginn in der Probe war, desto früher wird dieser Schwellenwert erreicht (desto kleiner ist der CT-Wert).
Absolute Quantifizierung: Man führt eine qPCR-Reihe mit einer Verdünnungsreihe einer Probe bekannter Konzentration (Standard) durch. Trägt man die erhaltenen CT-Werte gegen den Logarithmus der Ausgangskonzentrationen auf, erhält man eine lineare Standardkurve. Der gemessene CT-Wert einer unbekannten Probe kann dann über die Geradengleichung direkt in die absolute Molekülzahl umgerechnet werden.
Vergleichen Sie die Reaktortypen Festbettreaktor, Schlaufenbioreaktor und Rührkesselbioreaktor im Hinblick auf das Kriterium der auftretenden Scherkräfte bei empfindlichen Zelllinien.
Das Kriterium der Scherkraft ist entscheidend bei der Kultivierung scherempfindlicher, zellwandloser Säugetierzellen (z. B. CHO-Zellen zur Antikörperproduktion).
Rührkesselbioreaktor: Weist die höchsten Scherkräfte auf. Durch die mechanische Bewegung der Rührerblätter entstehen hohe lokale Scherspannungen und turbulente Wirbel, welche die Zellmembranen mechanisch zerstören können.
Schlaufenbioreaktor (Airlift): Weist geringe Scherkräfte auf. Die Durchmischung und Zirkulation erfolgt rein fluiddynamisch über den Dichteunterschied, der durch das gezielte Einspeisen von Gasblasen im Steigrohr erzeugt wird; es gibt keine mechanisch bewegten Teile.
Festbettreaktor: Weist die geringsten Scherkräfte auf. Die Zellen sind immobilisiert auf porösen Trägermaterialien (Matrix) fixiert. Sie werden lediglich von nährstoffreichem Medium kontinuierlich und scherarm umströmt, ohne dass die Zellen direkt den hydrodynamischen Kräften einer Strömung oder Gasblasen ausgesetzt sind.