Vectores de clonación
Células hospederas
Marcadores de selección
Reacción de cadena polimerasa
Síntesis de oligonucléotidos
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Dentro del contexto de la biología molecular ¿Qué es un vector?
Es una molécula de ADN que posee la capacidad de albergar un fragmento (gen) de material genético exógeno.
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¿Qué son las células hospedadoras? Dentro del contexto de la clonación y expresión de genes
•Son células vivas utilizadas como "anfitriones" para llevar a cabo la clonación y expresión de genes.
•Estas células son modificadas genéticamente para recibir un vector de clonación que contiene el gen de interés, permitiendo su replicación y expresión.
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¿Qué es un marcador de selección?
Es una secuencia de ADN utilizada para identificar y seleccionar células que han incorporado un gen específico.
Y pueden ser resistencias a antibióticos, proteínas fluorescentes u otras enzimas.
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¿Cuáles son los componentes principales necesarios para llevar a cabo una PCR? Independiente del equipo de laboratorio necesario (reactivos)
•Muestra de ADN.
•Primers (oligonucleótidos cortos complementarios a la secuencia objetivo).
•Enzima de polimerasa termoestable.
•Nucleótidos (A, T, C y G).
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¿Qué son los oligonucleótidos y cuales son sus principales aplicaciones?
Los oligonucleótidos son secuencias cortas de ADN (sintetizado) que se utilizan como cebadores (primers) para amplificar regiones específicas de ADN en la PCR y para la síntesis de genes.
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La diferencia entre vectores de clonación y de expresión es su finalidad, los vectores de clonación ... mientras que los vectores de expresión...
Los vectores de clonación son utilizados para almacenar secuencias y obtener grandes cantidades del ADN insertado o de la molécula recombinante.
Mientras que los vectores de expresión tienen como objetivo producir un tránscrito (ARN o proteínas).
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La introducción de un vector (virus) a una célula eucariota se le denomina...
Transducción
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Menciona un ejemplo común de marcador de selección utilizado en vectores de clonación y expresión:
Resistencia a antibióticos, como la ampicilina o la kanamicina.
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Menciona únicamente los nombres de 3 modalidades de la técnica PCR:
Doble de puntos si menciona 8
• PCR convencional
• PCR cualitativa
• PCR semicuantitativa
• PCR cuantitativa
• PCR múltiple
• PCR selectiva
• PCR in situ
• PCR anidada
• PCR en tiempo real
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¿Cuál es el rango de longitud típico para los oligonucleótidos utilizados en vectores de clonación y expresión?
Suelen tener una longitud de alrededor de 20 a 30 pares de bases (pb).
Aunque la longitud puede variar según el propósito y la técnica utilizada.
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Identifica y completa las partes faltantes:
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Menciona dos métodos para la preparación de células competentes:
•Tratamiento con solución de CaCl2
•Lavados consecutivos con una solución de glicerol (10 %).
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Identifica cuál es el marcador de selección:
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¿Qué formula describe la amplificación del producto de PCR? Explica cada parte de esta misma fórmula
Donde
P = Número de moléculas producto del PCR.
n = Número de ciclos.
T = Número de copias inicial de la molécula molde.
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¿Cuáles son los tres pasos principales en la síntesis química automatizada de ADN para la síntesis de oligonucleótidos?
Puntos dobles si explican la función de cada paso.
• Desprotección: Elimina los grupos protectores de los nucleótidos.
• Adición de nucleótidos: Incorpora los nucleótidos uno a uno en la secuencia deseada.
• Ciclación: Asegura la formación correcta del oligonucleótido.
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Un promotor inducible es un tipo de secuencia de ADN que controla el inicio de la transcripción de un gen en respuesta a una señal externa o molécula inductora.
Como consecuencia de lo anterior,
¿Cuáles podrían ser las ventaja de su uso?
La ventaja de utilizar un promotor inducible es que proporciona control preciso sobre tiempo y el nivel de expresión génica.
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Completa lo siguiente:
Para la preparación del vector para clonación se debe desfosforilar el vector para...
Impedir su autoligación del vector
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¿Por qué es importante utilizar marcadores de selección en los vectores de clonación y expresión?
Permiten identificar y seleccionar células que han incorporado correctamente el vector y el gen de interés, facilitando la obtención de células transformadas con éxito.
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¿Qué etapas comprende un ciclo típico de PCR?
Doble de puntos si describe la función de cada etapa.
Desnaturalización: Donde el ADN se separa en hebras individuales
Alineación o hibridación: Donde los primers se unen a las secuencias complementarias
Extensión: Donde la enzima de polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN a partir de los primers.
Amplificación final: Permite que la polimerasa termine la extensión de los productos a los cuales se encuentra unida
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Menciona al menos 3 métodos para purificar los oligonucleótidos sintetizados:
Doble de métodos mencionados, doble de puntos.
Se pueden purificar mediante técnicas:
•Cromatografía de deionización.
•Precipitación con alcohol.
•Electroforesis en gel.
•Columnas de purificación especializadas.
•HPLC
•Filtración por exclusión de tamaño o ultrafiltración.
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¿Cuáles son los vectores de clonación más utilizados?
Doble de puntos si menciona una breve descripción de cada uno.
Plásmidos
Son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se transmiten con independencia del cromosoma bacteriano.
Bacteriófagos
Son virus que infectan naturalmente bacterias (parásitos intracelulares) .
Cósmidos
Son vectores híbridos del ADN de un plásmido y los sitios cos del bacteriófago, permiten ampliar el rango de los insertos hasta 85 kb.
Cromosomas artificiales
Son fragmentos de ADN de gran tamaño que permiten transportar grandes insertos de hasta 1Mb.
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Para la clonación de un fragmento de ADN, existe un paso en el cual se menciona el concepto de "transformación celular" ¿En qué consiste?
Consiste en la adquisición de ADN exógeno, que le confi ere un nuevo fenotipo a la célula huésped.
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Menciona un ejemplo específico de una marcador de selección y cómo podríamos identificar las células que introdujeron el vector:
•Gen lacZ, se encuentra en el operón Lac de E. coli y codifica la enzima β-galactosidasa que produce un color azul.
•Gen GFP (green fluorescente protein), permite la emisión de fluorescencia cuando se expone a luz UV.
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¿Cuáles son las temperaturas que se tienen en un ciclo de PCR convencional y cuánto tiempo duran?
•95°C: 30 segundos.
•55 a 60°C: 30 a 40 segundos.
•72°C , según la longitud del producto, considerando la adición de 1000 nucleótidos en 60 segundos.
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¿Qué características se deben tener en cuenta al diseñar oligonucleótidos para su uso en vectores de clonación y expresión?
Doble de puntos si incluye explicación.
Se deben tener en cuenta
•Longitud adecuada y
•La temperatura de fusión (Tm)
Para asegurar una buena hibridación, evitar repeticiones y secuencias complementarias no deseadas, y tener una secuencia específica para el sitio de clonación o amplificación.